安捷倫實用攻略 | 方法開發(fā)時，如何選擇 C18 色譜柱？

在色譜方法開發(fā)過程中，分離度、柱效、峰形是考察色譜柱選擇性是否合適的主要性能指標。

方法開發(fā)中的分離度

根據(jù)分離度（Rs）公式，分離度的影響因素主要有柱效（N）、選擇性（α）和保留因子（或稱容量因子，k）：

公式1作為分離度改善的理論基礎。通常，方法開發(fā)過程中，通過提高化合物保留 (k)、提高柱效 (N)、以及提升選擇性 (α) 來達到分離度的改善。

選擇性因子（α）：

式中 k1 和 k2 分別是第一個峰和第二個峰的保留因子。

根據(jù)公式 1 和公式 2，當選擇性因子提高 0.1 時，對分離度的貢獻是 Rs 大約為原來的 1.8 倍。因此選擇性的改變對分離度的改善效果顯著，如圖 1 所示。

圖 1. 分離度與柱效、選擇性、保留因子的關系

與選擇性有關的因素：

固定相：選擇不同化學修飾的鍵合相（不同的 C18 柱或其它鍵合類型色譜柱）

流動相：調(diào)整有機相的類型、pH 值、鹽濃度、兩相比例等

柱溫

方法開發(fā)中的色譜柱選擇

在色譜固定相的選擇和使用中，最常用的鍵合相類型是十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）。不過，由于固定相物理特性與化學修飾的差異，使得不同的 C18 選擇性不盡相同。選擇色譜柱時，如果一種類型的 C18 柱分離度不足，就可以選擇與之選擇性差異較大的 C18 柱來進行優(yōu)化。

以 Agilent InfinityLab Poroshell 系列中的 C18 液相色譜柱為例：

Poroshell 120 EC-C18 為封端的碳十八固定相，對酸性、堿性、中性化合物都有良好的選擇性，已經(jīng)成為方法開發(fā)的首選，也是在 Agilent 1260 Infinity II 四元泵液相色譜系統(tǒng)中標配的色譜柱。

與 EC-C18 柱不同，Poroshell 120 SB-C18 柱卻是不封端的碳十八固定相。由于裸漏的硅醇基存在，可與待分離物發(fā)生氫鍵、離子間作用等，因此 SB-C18 的選擇性與封端的 C18 柱存在顯著差異?？梢岳眠@個特點，在方法開發(fā)時 SB-C18 和 EC-C18 通?？梢宰鳛榉椒ㄩ_發(fā)的起始色譜柱。另外，SB 的全稱是 StableBond，顧名思義意為“穩(wěn)定的鍵合相”，這里說的穩(wěn)定，主要是在C18硅烷長鏈的兩側(cè)采用異丁基進行立體的保護，使得 SB-C18 在低 pH 下有較好的耐受性能。

同樣采用 Poroshell 120 的硅膠，HPH-C18 與 EC-C18 和 SB-C18 又有所不同。在進行鍵合之前，在 Poroshell 硅膠的表面多孔層，先進行了有機雜化處理，再進行 C18 鍵合和封端修飾，得到的 HPH-C18 色譜柱具有了高 pH 耐受的特點。

因此，表面化學結(jié)構的差異，三種常用的 Poroshell C18 柱，在選擇性上具有顯著區(qū)別。表 1 列出了以 EC-C18 為基準，HPH-C18 與 SB-C18 的相似度因子 Fs。當 Fs 因子大于 3.0 時，固定相選擇性存在差異。

表 1. 三種固定相選擇性差異比較（以 EC-C18 為基準）

問渠哪得清如許，為有源頭活水來，新產(chǎn)品 Poroshell CS-C18 上市！

Poroshell 色譜系列在色譜分析行業(yè)已經(jīng)得到了廣泛的認可，安捷倫也一直在拓展 Poroshell 系列色譜柱的產(chǎn)品線。

2020 年 11 月，安捷倫推出了新產(chǎn)品 Poroshell CS-C18 柱，進一步拓展了 C18 固定相的類型。該固定相是在 Poroshell 實心核顆粒的表面多孔層在進行高 pH 耐受的雜化處理之后，再進行 C18 鍵合、封端和正電荷修飾，其中使用的鍵合相還進行了側(cè)立基的保護。這樣 CS-C18 固定相的表面，不僅具有 C18 提供的疏水作用、而且還具有正電荷的離子作用，選擇性也與其它的 C18 鍵合相有顯著差異。同時，硅烷鏈側(cè)立基保護、多孔硅膠表面雜化處理，使得固定相pH耐受范圍得到了拓寬。

在 Poroshell C18 的四種 C18 鍵合相中，涵蓋了 RPLC 模式下的主要作用力，選擇性彼此之間有顯著差異，見圖 2。利用這些固定相的選擇性差異，可以方便地進行方法開發(fā)中的色譜柱選擇。

圖 2. Poroshell 的 4 種 C18 固定相

應用實例

堿性條件下選擇性差異

在 pH=10 的體系下，耐堿的 CS-C18 與 HPH-C18 選擇性存在顯著差異。

圖 3. 農(nóng)藥組分在堿性體系下 LC-MSMS 色譜圖結(jié)果比較

酸性條件下選擇性差異

在酸性體系下，不同 Poroshell C18 柱的保留、分離度有顯著差異。

圖 4. 阿片類藥物在酸性體系下 HPLC 分析色譜圖比較

峰形及載樣量比較

在酸性體系下，在堿性藥物阿米替林的雜質(zhì)分析時，采用 CS-C18 與傳統(tǒng)封端的 C18 柱進行比較，CS-C18 柱對堿性組分具有更好的峰形、載樣量和分離度。

圖 5. 不同色譜柱對阿米替林及雜質(zhì)（0.25%）不同進樣量分析結(jié)果比較

酸性體系下 LC/MS 靈敏度比較

在甲酸體系下，在進行液質(zhì)聯(lián)用分析時，CS-C18 柱提供可更好的靈敏度、響應和峰形。

圖 6. 甲酸體系中低濃度標樣（50ng/ml） 在 LC/MS/MS 中靈敏度比較