組織工程被認(rèn)為是一種有潛力的方法，用于重建生物關(guān)節(jié)，尤其是在治療晚期骨關(guān)節(jié)炎方面，但目前在大型生物關(guān)節(jié)的再生方面還沒有取得重大進(jìn)展。本研究利用多噴頭協(xié)同生物打印技術(shù)設(shè)計(jì)和一體化制造了結(jié)構(gòu)差異化、成分異質(zhì)化、形態(tài)曲面不規(guī)則的大白兔兔肱骨頭再生仿生支架，利用動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓協(xié)同不同生化刺激信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)軟骨內(nèi)成骨的雙重調(diào)控。這項(xiàng)研究提供了一種多功能且可擴(kuò)展的修復(fù)大型關(guān)節(jié)的方法。

仿生支架：用于生物組織工程和再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵材料，其設(shè)計(jì)和制造得與自然生物組織相似。仿生支架在晚期骨關(guān)節(jié)炎患者治療中發(fā)揮重要作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）：是一種很有前途的骨和軟骨組織工程自體細(xì)胞來源，通過調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化及微環(huán)境中復(fù)雜信號(hào)的空間調(diào)控，從而影響B(tài)MSCs的分化方向促進(jìn)軟骨細(xì)胞生成，這可能極大地有利于肱骨頭的成功重建。多噴頭協(xié)同生物3D打印技術(shù)：是一種新興的生物制造技術(shù)，它可以采用多種噴頭將含有不同生長(zhǎng)因子和高密度活細(xì)胞輸送到水凝膠、大分子和生物材料中，從而創(chuàng)建高度仿生的生物活性結(jié)構(gòu)。研究人員使用這項(xiàng)技術(shù)制備具有不同結(jié)構(gòu)、成分的大白兔肱骨頭仿生支架，并進(jìn)行了肩關(guān)節(jié)置換，用以分析術(shù)后兔肱骨關(guān)節(jié)正常結(jié)構(gòu)再生和功能重建情況。

研究通過計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)兔肱骨近端肱骨頭獲得3D數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)生物支架。

圖1 基于CAD/CAM技術(shù)構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)和成分的兔肱骨頭支架。A-D）新西蘭白兔左肱骨頭掃描和假體設(shè)計(jì)效果圖。E-H）分層肱骨頭設(shè)計(jì)并打印路徑設(shè)計(jì)。I-L）肱骨頭3D打印的制備過程。M，N）打印模型和物理對(duì)象。O，P）肱骨頭的基底視圖和放大圖像。

為了驗(yàn)證人工肱骨頭的生物相容性，研究人員將每組生物打印支架進(jìn)行培養(yǎng)1、3、5和7天后用活死細(xì)胞染色。BMSC均勻分布在支架之間（圖2A，第3天）。在不同的支架中觀察到高細(xì)胞活力和少量死細(xì)胞（超過95%），統(tǒng)計(jì)分析表明組間沒有顯著差異（圖2B）。此外，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)定顯示細(xì)胞增殖隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。結(jié)果表明，所制備的肱骨頭支架具有良好的生物相容性，可用于細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)。

為了評(píng)估動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓協(xié)同不同生化因素對(duì)支架中不同區(qū)域骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨形成和軟骨內(nèi)成骨的影響，研究人員采用RT-PCR來評(píng)估透明軟骨相關(guān)基因(II型膠原(COL-II)、聚集蛋白(AGG)和Sry相關(guān)HMG -9 (SOX9))和纖維軟骨相關(guān)基因(I型膠原 (COL-I)、X型膠原 (COL-X)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13 (MMP-13))在體外培養(yǎng)1、7、14天后在不同支架中的表達(dá)。結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓聯(lián)合PTH雙刺激支架能更好地誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化，抑制軟骨內(nèi)成骨，而動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓聯(lián)合羥基磷灰石(HA)可刺激軟骨內(nèi)成骨的發(fā)育過程，有利于BMSCs體外成骨。

為了進(jìn)一步評(píng)估生物3D打印肱骨頭支架在蛋白質(zhì)水平上雙向調(diào)節(jié)BMSCs軟骨內(nèi)骨化過程的效果，研究人員在體外培養(yǎng)30天后，對(duì)不同支架的外層和內(nèi)層進(jìn)行了透明軟骨化標(biāo)志蛋白（COL-II）和纖維軟骨化標(biāo)志蛋白（COL-X）的免疫熒光染色。結(jié)果表明，在動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓協(xié)同PTH的聯(lián)合刺激下，軟骨層支架中BMSCs中軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程受到較好的抑制，快速生成并維持透明軟骨表型；而在在動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓刺激協(xié)同HA誘導(dǎo)的組合下，軟骨下骨層支架中BMSCs的軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程得到顯著促進(jìn)，快速生成軟骨下骨。

為了進(jìn)一步評(píng)估不同刺激對(duì)軟骨再生的促進(jìn)作用，進(jìn)行了組織學(xué)評(píng)估，如蘇木精-伊紅染色(he)、Masson–三色染色(Masson)、番紅O/固綠染色(SO/FG)、阿辛藍(lán)染色(AB)和甲苯胺藍(lán)染色(TB)。結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓聯(lián)合PTH刺激可協(xié)同促進(jìn)肱骨頭支架表面軟骨組織的形成。

通過對(duì)肩關(guān)節(jié)進(jìn)行X線和MRI掃描，以評(píng)估植入肱骨頭修復(fù)體的固定和再生組織的形成。結(jié)果顯示，雙刺激組的新生骨體積明顯大于其他三組，MRI也證實(shí)所有植入的假體均保留在關(guān)節(jié)內(nèi)，無脫位；且雙刺激組新再生的軟骨組織比生物力學(xué)和生化組更厚。

該研究展示了一種生物3D打印關(guān)節(jié)仿生支架，它具有類似于天然肩關(guān)節(jié)肱骨頭的各向異性組織結(jié)構(gòu)和多樣化成分。研究通過動(dòng)態(tài)力學(xué)加壓協(xié)同不同生物化學(xué)刺激雙向調(diào)控干細(xì)胞內(nèi)的軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)了關(guān)節(jié)表層透明軟骨和關(guān)節(jié)下骨的一體化再生。這種應(yīng)用支架架構(gòu)、生物化學(xué)和生物力學(xué)協(xié)同刺激的方法可能對(duì)大型關(guān)節(jié)的高效再生產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，有望在動(dòng)物肩關(guān)節(jié)重建以及其他大關(guān)節(jié)（如膝蓋、髖部和腕關(guān)節(jié)）重建領(lǐng)域取得進(jìn)展。此方法還為設(shè)計(jì)和制造大型、解剖匹配的臨床相關(guān)植入物提供了一種借鑒方案。該研究通過應(yīng)用生物力學(xué)和生物化學(xué)刺激以及各向異性結(jié)構(gòu)，有望進(jìn)一步推動(dòng)生物3D打印大關(guān)節(jié)的發(fā)展。